Bacillus subtilis được sử dụng phổ biến trong sản xuất enzyme công nghiệp nhờ ba đặc điểm nổi bật là an toàn, dễ nuôi cấy và tiết protein hiệu quả. Tuy nhiên, việc sử dụng B. subtilis cho sản xuất protein tái tổ hợp còn rất hạn chế mà nguyên nhân chủ yếu là do không có hệ thống biểu hiện mạnh thích hợp cho chủng vi sinh vật này. Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi xây dựng nhóm nghiên cứu phát triển vector biểu hiện. Đây là hướng nghiên cứu cơ bản có tính ứng dụng cao, có khả năng phát triển công nghệ nền định hướng cho sự phát triển ngành công nghiệp protein tái tổ hợp trong nước.

Hai vector đầu tiên của hệ thống này là pHT01 (biểu hiện nội bào) và pHT43 (biểu hiện ngoại bào), được thương mại hóa từ năm 2007 đã khởi đầu cho khuynh hướng nghiên cứu cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp trong B. subtilis của nhóm. Hệ thống biểu hiện này sử dụng promoter mạnh Pgrac, được dung hợp từ promoter mạnh groESL có nguốn gốc từ B. subtilis với operator lac (lacO) từ Escherichia coli, cảm ứng bằng IPTG. Nhờ có hệ thống điều hòa hoạt động tốt trên E. coli, promoter Pgrac đã làm đơn giản quá trình dòng hóa; đồng thời cho chép biểu hiện protein mục tiêu với mức độ cao trên B. subtilis, lên đến 16% protein tổng số.

Từ những thành công ban đầu, chúng tôi tiếp tục cải tiến nhằm tối ưu hóa và tăng hiệu quả sử dụng của hệ thống plasmid pHT trong B. subtilis. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc khai thác cơ sở dữ liệu (phối hợp với hướng Tin – Sinh học) và tiến hành thực nghiệm nhằm khai thác các thông tin thật sự có ý nghĩa về sự điều hòa biểu hiện gen.

Nhóm nghiên cứu được dẫn dắt trực tiếp bởi TS. Phan Thị Phượng Trang cùng với sự hỗ trợ của TS. Nguyễn Đức HoàngGS. Wolfgang Schumann. Chúng tôi tin rằng đây sẽ là hướng nghiên cứu đầy tiềm năng và sẽ gặt hái được nhiều thành công trong thời gian sắp tới.

Định hướng nghiên cứu

Cải thiện độ mạnh của promoter Pgrac. Thông qua việc thay đổi các nucleotide ở các vị trí bảo tồn như UP element, vùng -35, vùng -15, vùng -10 và vùng +1, độ mạnh của promoter được cải thiện đáng kể. Các khảo sát gần đây với những promoter mới cho kết quả rất khả quan. Pgrac100 được phân phối trên thị trường từ năm 2012, với việc điều chỉnh ở các vùng UP element, -35 và -15 đã giúp biểu hiện protein tái tổ hợp nội bào lên đến 30%.

Cải thiện độ bền của mRNA. Độ bền của mRNA được cải thiện thông qua việc thay đổi trình tự nucleotide từ vùng +1 đến codon mở đầu tạo nên cấu trúc sterm-loop giúp hạn chế sự phân hủy mRNA và tăng hiệu quả bám của ribosome. Một trong những promoter tiêu biểu cho hướng nghiên cứu này là Pgrac212. Promoter này được thiết kế với một yếu tố ổn định mRNA ở đầu 5’ mRNA (controllable stabilizing element-CoSE) và một khoảng cách tối ưu giữa RBS (Ribosome Binding Site) và lacO đã giúp tăng thời gian bán rã của mRNA lên đến 60 phút (gấp 3 lần so với Pgrac).

Giảm mức độ biểu hiện nền của protein mục tiêu trong E. coli. Một vector biểu hiện tốt cho B. subtilis sẽ có đặc điểm cho phép biểu hiện protein mục tiêu ở mức thấp trong E. coli khi không có chất cảm ứng, tạo điều kiện thuận lợi cho việc dòng hóa gen mục tiêu một cách dễ dàng. Do đó, việc giảm mức độ biểu hiện nền của protein mục tiêu trong E. coli bằng cách sử dụng các codon hiếm hoặc các gen mã hóa cho Rop (repressor of primer) cũng là một trong những hướng nghiên cứu được chúng tôi quan tâm. Một số kết quả ban đầu cho thấy, việc tận dụng sự khác biệt về codon hiếm trong E. coliB. subtilis như AGA (Aginine) và GGA (Glycine), đã giúp hạn chế biểu hiện protein mục tiêu trong E. coli khi không cảm ứng nhưng ít ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất trong B. subtilis.

Sử dụng các đuôi tinh chế hiệu quả. Việc thêm vào các đuôi tinh chế nhằm tăng khả năng thu nhận và tinh sạch protein mục tiêu cũng đã được tiến hành với His-tag (pHT253, pHT254), Strep-tag (pHT255) – được phân phối bởi Công ty Công nghệ Sinh học phân tử Mobitec, CHLB Đức. Đồng thời, các khảo sát nhằm đánh giá hiệu quả vị trí đuôi dung hợp (đầu N hoặc đầu C so với protein mục tiêu) cũng được thực hiện với các gen chỉ thị β-galactosidase (BgaB) và GFP. Đây là những thông tin rất hữu ích, giúp cho người sử dụng có những lựa chọn phù hợp.

Cơ hội và triển vọng

Định hướng thương mại hóa, sản xuất quy mô lớn cũng là xu thế phát triển được chú trọng của hướng nghiên cứu về hệ thống biểu hiện. Do đó, chúng tôi sẽ tạo mọi điều kiện tốt nhất nhằm tăng cường và mở rộng hợp tác với những đơn vị có nhu cầu sử dụng hệ thống pHT để biểu hiện protein tái tổ hợp trong B. subtilis.

Đào tạo nguồn nhân lực chất lượng cao trong lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng là một khía cạnh mà chúng tôi quan tâm. Vì vậy, sinh viên và học viên khi tham gia hướng nghiên cứu sẽ có cơ hội thực tập và làm quen với các thao tác phòng thí nghiệm, cách bố trí xắp sếp thí nghiệm cũng như thành thạo về các kĩ thuật sinh học phân tử cơ bản.

Các kết quả thu được đã mở ra xu hướng nghiên cứu cơ bản mới làm kim chỉ nam cho việc phát triển ngành công nghệ protein tái tổ hợp ở nước ta. Trong bối cảnh hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam đều phụ thuộc vào hệ thống biểu hiện thương mại có xuất xứ từ nước ngoài, hướng nghiên cứu của chúng tôi hứa hẹn sẽ góp phần quan trọng trong việc định hướng và tạo ra các chủng vi sinh vật có chất lượng cao phục vụ cho ngành công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trong nước.

Tài liệu tham khảo:

[1] Nguyen HD, Nguyen QA, Ferreira RC, Ferreira LC, Tran LT, Schumann W. 2005. Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability. Plasmid 54: 241-248.

[2] Phan TTP, Nguyen HD, Schumann W. 2006. Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Protein Expr Purif 46: 189-195.

[3] Nguyen HD, Phan TTP, Schumann W. 2007. Expression vectors for the rapid purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Curr Microbiol 55: 89-93.

[4] Phan TTP, Schumann W. 2007. Development of a glycine-inducible expression system for Bacillus subtilis. J. Biotechnol. 128(3): 486-499.

[5] Phan, T.T.P. and Schumann, W. 2009. Transcriptional analysis of the lysine-responsive and riboswitch-regulated lysC gene of Bacillus subtilis. Curr Microbiol 59(4): 463-468.

[6] Phan TT, Nguyen HD, Schumann W. 2010. Establishment of a simple and rapid method to screen for strong promoters in Bacillus subtilis. Protein Expr Purif 71: 174-178.

[7] Phan TT, Nguyen HD, Schumann W. 2012. Development of a strong intracellular expression system for Bacillus subtilis by optimizing promoter elements. J Biotechnol 157: 167-172.

[8] Phan TTP, Nguyen HD, Wolfgang Schumann. 2013. Construction of a 5'-controllable stabilizing element (CoSE) for over-production of heterologous proteins at high levels in Bacillus subtilis. J Biotechnol. 168(1): 32-39.